مجموعة محاضرات لطلبة البيولوجيا سنة اولى ل م د

هذه عبارة عن مجموعة من المحاضرات المتعلقة بمقياس Biologie cellulaire

Organisation cellulaire

Contrairement à ce que l'onpense, les cellules ne sont pas toutes construites sur le même schéma.Bien sûr, elles se ressemblent, elles sont toute constitué d'uncytoplasme entouré d'une membrane, contiennent un génome à base d'ADNet les même règles physiologiques peuvent dans la plupart des cas,s'appliquer à toutes. Mais au delà de ces ressemblances, il existe desdifférences fondamentales. Il ne s'agit pas de simples différencesmorphologique, mais des architectures cellulaires fondamentalementdifférentes. Ces différences permettent de différencier deux types debase d'organisation cellulaires et trois grandes branches dans l'arbregénéalogique de la vie. Ces types sont disjoints, il n'y a aucunintermédiaires entre eux.
Les domaines du vivant

Les scientifiques du passéavaient divisé le monde en 3 règnes : animal, végetal et minéral. Cettedescription, basée sur ce qui était visible à l'oeil nu était inexacteparce qu'elle oubliait tout un pan de la vie tout en lui reliant lemonde non-vivant. La découverte des cellules au XVIIeme sciecle puiscelle des organismes unicellulaires ne va pas modifier cet état dechose; en se basant sur l'autotrophie et l'hétérotrophie de cesorganismes unicellulaires, ils seront répartis entre végétaux etanimaux. C'est ainsi que les bactéries sont classées dans les végétaux.
En 1866, Haeckel estime que cette répartition est inadaptée, ilregroupe les unicellulaires dans un nouveau regne, les protistes. Ladecouverte du microscope électronique au debut du sciecle va permettrede découvrir la différence fondamentale entre les bactéries et lesautres cellules. Cela abouti en 1938 à la séparation du règne desmonères (ou procaryote) depuis les protistes par Copeland. En 1969,Whittaker sépare les champignon des végétaux et crée le régne desfongidés. 9 ans plus tard, avec Margulis, il effectue un ultimeremaniement de la classification en séparant les alguespluricellulaires des végétaux et en les regroupant avec les protistes.L'ensemble est renommé proctociste.
Dans les années 70, lemonde vivant comportait donc deux grands types cellulaires, lesprocaryotes et les eucaryotes, le second ayant connu une évolutionvariée lui ayant permis de générer 4 régnes alors que les procaryotessemblaient moins diversifiés. Plus récemment, les progrés de labiologie moléculaire vont permettre d'effectuer une nouvelledécouverte. Les procaryotes peuvent être divisée en deux groupescellulaires aussi fondamentalement différents que le sont les bactériesdes eucaryotes : les eubactéries et les archéobactéries. Cettedecouverte abouti à la proposition par Woese en 1990 d'une division dumonde vivant en 3 domaines basés sur la structure cellulaire:eubactéries, archéobactéries et eucaryotes.
Les eucaryotes

Les Eucaryotes sont lescellules qui constituent tout l'environnement que nous voyons, lesplantes, les animaux et champignons ainsi que divers espècesunicellulaires tels que les amibes ou les paramécies. Ils sontcaractérisées par la présence d'organites, sortes d'organesintracellulaire. Parmi eux, un organite est toujours présent : lenoyau, qui contient l'information génétique de la cellule. Il estd'ailleurs à l'origine du nom de ce type (eucaryote = vrai noyau enlatin). La structure génétique de ces cellules est constituée deplusieurs brins linéaire d'ADN (les chromosomes) et par des gènes en"mosaique", c'est à dire que les zones codantes du gène sont découpéesen morceaux qui sont séparés par des zones non codantes.
Les originalités des eucaryotes ne se limitent pas à des considérationsgénétiques. Celles-ci sont souvent de grande taille, ce qui lesfragilise et diminue leur surface d'échange avec le milieu extérieur.Mais surtout, elles vont développer un cytosquelette, sorte decharpente intracellulaire mobile qui va permettre à la fois de serigidifier (et de compenser leur fragilité) et de se déformer de façoncontrôlée, phénomène qui est à l'origine du mouvement des animaux, maisaussi des cellules phagocytaire et qui est donc directement responsablede la grande variété des formes animales qui existent.
Les procaryotes

Par opposition, lesprocaryotes sont les cellules sans noyau. Ces cellules sont de petitestailles et sans organites intracellulaires. Leur matériel est constituéd'un unique chromosome circulaire et de divers morceaux d'ADN égalementcirculaires mais beaucoup plus petit et en nombres variables (memeentre les individus d'une meme espèce, voire à des moments différentsde la vie d'un meme individu) , les plasmides. En effet, alors que lechromosome se duplique de façon synchronisée avec la divisioncellulaire, les plasmides se repliquent de façon indépendante et sontrépartis au hasard entre les deux cellules filles lors d'une division.De plus, certains plasmides ont la capacité de s'intégrerprovisoirement au chromosome. Enfin, ces cellules ne contiennent pas decytosquelette. Elles sont en général rigidifiées par un revetementexterne et sont indeformables sauf chez les plus petites espèces). Lastructure des gènes différe également de ceux des eucaryotes, chez lesprocaryotes, ils sont continus et plusieurs d'entre eux sont regroupésau sein d'un meme ensemble fonctionnel, l'operon.
Eubactéries et archéobactéries

Pendant longtemps,procaryote a été synonyme de bactérie, jusqu'à la découverte en 1990d'un type cellulaire nouveau, de toute évidence procaryote, mais qui nesont pas des bactéries. Les bactéries ont donc été renomméeseubactéries (vrai bactéries) et ce nouveau type cellulairearchéobactérie. Ces dernières partagent avec les eubactéries lapossession d'un chromosome circulaire unique et l'absence decytosquelette. Mais elles comportent aussi des caractères eucaoryotestels que les gènes en mosaique et une structure génétique semblable.Ces caractèristiques intermédiaires les ont fait considerer comme lesancetres des deux groupes. Toutefois, elles disposent de particularitésoriginales, leur membrane notamment est constitituée de lipidesretrouvés nulle part ailleurs dans le monde vivant. La principalecaractéristique des archeobactéries, à l'origine de leur popularité,est leur capacité a survivre dans les milieux extrèmes : eaux trésacides (pH < 1) ou très salées (mer morte) ou très chaude ( >120°C) ou très froides ( < 0°C), bien que la plupart d'entre ellesvivent dans des milieu plus cléments.
Les procaryotes

Le cytosquelette

Le cytosquelette est l'élément quidiffére le plus les eucaryotes des procaryotes. Tous les eucaryotes ontun cytosquelette développé alors que les procaryotes n'en ont pas, àl'exception des spirochè qui possèdent des molécules semblables à del'actine mais sans atteindre la sophistication d'un vrai cytosquelette.
Le cytosquelette est un réseau defibres intracellulaires. Il est constitué de trois grandes familles deprotéines, très conservées dans l'évolution : les filaments épais detubuline ou microtubules, les filaments fins d'actine ou microfilamentset les filaments intermédiaires. Les deux premières familles sont trèshomogènes et ont été très étudiées. Elles sont présentes dans toutesles cellules et les molécules constitutives sont les mêmes, lesgénéralités qui vont suivre s'appliquent à eux seuls. Les filamentsintermédiaires sont en revanche plus hétérogène, constitués demolécules qui diffèrent selon le type cellulaire, ils ne seront pasabordés ici.
Bien que de composition et defonction très différentes, les filaments du cytosquelettes ont despropriétés communes. Les microtubules et les microfilaments sontconstitués d'une charpente protéique fibrillaire formée par lapolymérisation d'une ou de deux molécules de protéine apparentée,stabilisée par des protéines annexes appartenant à d'autres familles.
Ces filaments sontdynamiques (c'est pourquoi certains spécialistes préfèrent parler decytomuscle), les protéines constitutives peuvent exister sous deuxformes dans la cellules : monomèriques, solubles et dispersées dans lecytoplasme ou insolubles et organisées en filaments. Il existe un seuilde concentration des monomères au dessus duquel les filaments seforment par polymérisation des unités moléculaires et en dessous duquelils se dépolimérisent. Le filament est polarisé, une extrémité noté + àun seuil plus bas que l'autre extrémité noté -. A concentration égale,le coté + croit plus vite (ou se dépolarise - vite que le coté -). Ilexiste également une plage de concentration pour laquelle le coté +croit alors que le coté - decroit, cela entraine une migration dufilament à travers la cellule, où s'il a une position fixe, unphénomène de tapis roulant. La polymérisation et la dépolymérisationconsomment de l'energie et la valeur des seuils est controlé par lacellule de manière très fine.
Au réseau fibrillaire d'autres types de protéines peuvent se fixer.Certaines protéines sont fixes et assurent la liaison des réseauxintracellulaires avec le reste de l'architecture cellulaire. D'autremolécules sont consommatrice d'énergie appartiennent à l'ensemble desmoteurs. Elles possèdent un point d'ancrage sur les filaments etpeuvent migrer le long de ceux ci, et également un autre pointd'ancrage ce qui leur permet de transporter des protéines ou organitesle long de ce réseau. La protéine fixée peut être un autre moteurassocié à son filament, ce qui permet d'organiser la structure ducytosquelette et déplaçant les filaments les uns par rapports auxautres.









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Les microtubules

Les microtubules sont lesplus épais (25nm) des filaments cytosqueletique. Ils interviennent danstous les mouvements intracellulaires, migration des organites dans lacellule, transport axonal dans les neurones mais aussi séparations desdeux jeux de chromosomes lors de la division cellulaire.
Formation

Les microtubules sont despetits tubes de 25 nm de diamêtre, la lumière faisant 10 nm. Ils sontformé par la polymérisation de deux protéines différentes : lestubulines. La tubuline alpha s'associe avec la tubuline beta pourformer des doublets. A ce niveau, le GTP se lie au doublet sur un sitede la tubuline beta. Un changement de conformation des protéines permetà ces doublets de s'assembler pour former un protofilament. Enfin, 13protofilaments forment ensemble un filament creux de microtubule. Deuxprotéines différentes peuvent se fixer à l'édifice. La dynéine,présente notamment dans les cils et les flagelles et la protéine tau.On peut trouver dans la cellules des microtubules doubles ou triple. Ils'agit de microtubules qui ont en commun quelques protofilaments, 3 auniveau de chaque point de jonction.
En réponse à un signalcellulaire, le GTP peut s'hydrolyser pour former du GDP. Le microtubuledevient alors instable. Il peut se dépolymeriser totalement en quelquesseconde, ce qui est beacoup plus rapide que ce que permettrait unedépolarisation par les extrémité comme evoquée dans l'introduction. Lapolymérisation et la dépolymérisation des microtubules est donc unphénomène dynamique, finement contrôlées par la cellule.
In vitro, la polymérisationnécessite la présence pour démarrer de centre de nucléation, c'est àdire de très petits fragments de microtubules. Dans la cellule, de telscentre n'existenr, mais une structure en tiens lieu, le centreorganiteur des microtubules (COMT). Chaque cellule possède un ouplusieurs COMT. Ils sont constitués d'un centrosome entouré d'unensemble complexe de protéine encore mal identifiées avec des granules denses aux électronsà la périphérie de la structure. Le centrosome est constitué de deuxcylindres de 9 triplets de microtubules (les centrioles) positionnés àangle droit. Ce centrosome est doué de continuité génétique, bienqu'aucun ADN n'ait été trouvé dans la structure, les deux centrioles seséparent, chaque centriole isolé déclenche la synthèse d'un autrecentriole pour reconstituer un centrosome complet. Un centrosome nepeut pas apparaître à partir de rien dans une cellule. Cette propriétélaisse penser que le centrosome et le flagelle (seul organite à base decentrosome) serait tout ce qui resterait d'une endosymbiose. Toutefois,comme aucun procaryote actuel ne possède de centrosome, l'origine del'organisme serait donc dans un type nouveau (ni bactérie, niarchéobactérie) qui aurait aujourd'hui disparu ou n'aurait pas encoreété découvert. D'autres scientifiques situent toutefois son originedans les spirochète, la question est encore débattue.
La présence d'un COMT modifie les propriété des microtubules.L'extrémité - est à proximité du COMT alors que la + est est éloignée.La concentration nécessaire pour obtenir une polymérisation est trèsabaissée, et une baisse de la concentration en tubuline ne diminue pasla longueur des filaments mais leur nombre. Tout ce passe comme si leCOMT avait plusieurs sites de nucléation dont le nombre dépend de laconcentration en tubuline, tout centre inoccupé donne aussitôtnaissance à un nouveau filament.
Les structures

En dehors des microtubulesqui traversent la cellule, ils participent à la formation de structuresplus complexes. Les deux que nous verrons sont le fuseau mitotique etles flagelles.
Le fuseau mitotique

Ce fuseau de microtubuleintervient lors de la mitose dans la séparation des deux jeux dechromosomes entre les cellules filles. Avant la mitose, toutes lesstructures microtubulaires de la cellule se dépolymèrisent, cils etflagelles compris. Au départ, l'aster, situé à proximité du noyau, sedivise, chaque aster se déplace à une extrémité de la cellule, filantderrière eux le fuseau mitotique. Chaque aster est en réalité un COMT,mais sont aspect en étoile viens de ce que tous les centres de







nucléation doivent êtreoccupés, pas seulement ceux impliqués dans la formation du fuseau. Lesautres filaments rayonnants sont les fibres astrales. Les filaments nesont pas continuité d'un aster à l'autre, la cohérence est assurée aucentre par des protéines connectrices.
Les filaments du fuseaumitotique vont se fixer par leur extrémité + à une structureparticulière du centromère des chromosomes condensés, le kinétochore.Chaque kinétochore reçoie une quarantaine de filaments. Quand tous lescentromères sont fixés à des microtubules, les deux chromatides dechaque chromosome se séparent. Les microtubules vont alors seretracter, entrainant les chromatides avec elles. En fait, c'est lechromatide qui migre le long du microtubule grace à des molécules dekinésines présentent dans le kinétochorere, le filament se dépolarisantjuste derrière lui.
A la fin de la mitose, lesdeux jeux de chromosomes sont donc séparés, chacun à une extrémité dela cellules. Le fuseau mitotique va se désorganiser, la tubulineservira à reconstruire le cytosquelette des deux nouvelles cellules.Après la séparation effectives des cytoplasme, la cellule vareconstituer toutes ses structures microtubulaire.





Les flagelles












Les flagelles et les cilssont des expansions membranaires extracellulaires qui possèdent lapropriété de battre. La différence entre les deux structures est lataille qui conditionne le mode de fonctionnement : le flagelle est pluslong que la longueur d'onde du battement, il ondule; le cil est pluscourt, il bat. La forme du flagelle est assurés par une charpente demicrotubules, l'axonème (image ci contre), au coeur de l'expansionmembranaire. Le centre est occupé par un doublet de microtubulesenveloppé d'un manchon protéique. Ce doublet est entouré d'un cylindrede 9 doublets de microtubules partiellement fusionnés. Ces doubletssont reliés entre eux par des bras de dynéine et avec le doubletcentral par les bras rayonnants. &Agrave; la base du flagelle, dansle cytoplasme, se trouve le corps basal. Il est constitué de 9 tripletsde microtubules disposés en cylindre. De microtubules de chaque tripletsont en continuité avec ceux des doublets periphériques de l'axonème,le doublet central s'arrête à la limite du cytoplasme et n'arrive pasau corps basal.
Les flagelles battent parglissement des doublets de microtubules entre eux. C'est la dynéine,qui en hydrolysant l'ATP, assure ce glissement. L'axonème étantcylindrique et le glissement se produisant dans le même sens relatifpour tous les doublets, la structure devrait se vriller. Ce sont lesautres proétines qui transforment ce vrillage en battement.

Les fonctions intracytoplasmiques

Les microtubules sontimpliqués dans la répartition des éléments intracytoplasmiques. Ilssont responsables d'une part de l'intégrité des structures cellulaires,d'autre part des mouvements intracytoplasmiques, comme montré dans lecas du fuseau mitotique. Les microtubules sont associé à un moteurprotéique constitué de kinésine. Ce moteur utilise les microtubulescomme rails pour déplacer des organites ou d'autres microtubules. Lesmicrotubules constituent donc le système majeur de répartitionintracellulaire.



Les microfilaments

Les microfilaments sont desfilaments fins (9 nm) constitué d'actine, éventuellement ramifiés. Ilssont impliqués dans des mouvements de grande ampleur impliquants ladéformation de la structure cellulaire : contraction, migration,pseudopode, à l'exception des mouvements des cils et flagelles dont lemoteur est constitué de tubuline. Leur polymérisation et leurdépolimérisation permet à la cellule de contrôler la fluidité ducytoplasme et de générer des mouvements qui permettent à la cellule demigrer. A cela s'ajoute l'effet des protéines motrices qui augmententleurs possibilités
Constitution

Les microfilaments sontconstitués d'un coeur d'actine associé à diverses protéinesaccessoires. Le monomène d'actine est l'actine G (pour globulaire).Cette protéine est tellement conservée au cours de l'evolution que l'onpeut obtenir des structures fonctionnelle en mélangeant l'actine Gprovenant de plusieurs espèces. La polymérisation de l'actine produitun brin en forme de double hélice. L'actine F (pour fimanent) eststabilisé par un filament de tropomyosine inséré dans le sillon largede la double hélice. Diverses protéines assurent le coiffage dufilament (structure en bout de filament pour stabiliser sa longueur),le pontage de deux filaments pour construire des structures en 2 ou 3dimensions et des protéines d'ancrage à d'autres structure.






Les myosines








Les propriétés contractilesdes filaments d'actine sont dûes à une famille de protéines motricesspécifiques : les myosines. Contrairement à l'actine, les myosines sonttrès diversifiées. Les différences jouent sur le système de régulationde la contraction que sur l'organisation spatiale des filaments demyosine. Le monomère de myosine est constituée d'une longue queue,portant deux têtes flexibles à une extrémité, la molécule est en formede Y. La tête flexible possède un site de liaison à l'actine et un sitepour l'ATP, c'est elle qui est responsable de l'aspect moteur de laprotéine, la queue ayant une fonction d'ancrage.
Bien que les modes derégulation soient très diversifiés, le fonctionnement de tous les typesde myosine est similaire. En présence de calcium et d'ATP, la tête dela myosine s'accroche au filament d'actine. L'hydrolyse de l'ATPprovoque la rotation de la tête et sa séparation du filament d'actine.Le départ de l'ADP de la tête de la myosine lui permet de reprendre saforme initiale. A la fin du mouvement, la molécule de myosine a glisséle long du filament d'actine. Le sens d'accrochage du filament d'actinepar rapport à la myosine est polarisé. Pour que le mouvement ait lieu,il est indispensable que les deux éléments actine et myosine soientcorrectement orientés.
Les molécules de myosines forment 3 types de structures en fonctions des besoins de la cellules :
Lesmolécules se disposent tête beche pour former un dimère. Plusieursdimères peuvent s'assembler en cylindre pour former un filament epais.Les têtes de la myosine sont situées aux extremités du filament. Lamigration de l'actine à lieu en sens opposée à chaque extremité dufilament. Ce type de structure se trouve notamment dans le musclestrié.
Lesdimère de myosine se disposent pour former un ruban. La polarité estdifférente de chaque côté du ruban. Ce type de structure est présentdans les muscles lisses et les cellules musculaires.
Pourles minimyosines, forme de myosine avec une queue réduite, il n'y a pasde formation de structures multimoléculaires. Ces minimyosinesutilisent les filaments d'actine pour transporter des organites.

Structures

Les microfilaments sont inclus dans deux grands réseaux filamenteux: un reseau sous membranaire et les cables de stress.
Le réseau sous membranaireest un réseau de filaments d'actine situé sous la membrane plasmique.Il constitue une charpente similaire à la charpente des domesgéodésiques. Ce réseau permet à la cellule de contrôler sa forme et departiciper au déplacememt.
Les cables de stress sontdes filaments d'actine qui traversent le cytoplasme. Ils sont ancrésd'un coté à la membrane plasmique au niveau des points focaux et del'autre à un point focal de la membrane opposé ou à une structurecytoplasmique appelé corps dense. Les points focaux sont desassemblages de protéines dont l'une d'entre elle, la taline esttransmembranaires. Chez les animaux, la partie extracellulaire de cesprotéines est relié à la matrice extracellulaire ce qui assurent lacontinuité mécanique du tissu de par et d'autre de la membraneplasmique. Le cable de stress est constitué d'une succession de corpsdenses composés d'alpha actinine. Ces corps denses servent d'ancrage àdes filaments fins d'actine, l'extrémité + est fixée aux corps dense.L'actine ne relie pas deux corps denses, mais s'arrête au milieud'entre eux ou se trouve l'extrémité - du filament, ce sont des rubansbipolaires de myosine qui assurent la continuité du cable. Les cablessont disposés de façon à résister aux forces qui s'exercent dans lacellule.

D'autres structuresimpliquent les filaments d'actine : les voiles de migration desfibroblastes, les spikes des neurites en croissance, les stéréocils descellules auditives, etc...

La membrane plasmique


La membraneplasmique constituent l'interface entre la cellule et son milieu. Elleassure donc à la fois un rôle de barrière en empêchant les moléculescellulaires de partir et les molécules extérieures d'entrer librement,et un rôle de barrière en sélectionnant les éléments qui peuvent entrerou sortir. Toutefois, ses fonctionnalités ne s'arrêtent pas là. C'estle prer élément rencontré par les molécules porteuses d'information,comme les hormones, les neurotransmetteurs ou diverses espèceschimiques importantes pour la cellule. C'est principalement la membranequi permet à la cellule de connaitre son environnement et d'agir surlui. La membrane est donc un organite fondamental aux fonctionsmultiples que nous allons maintenant détailler.


<">Structure des membranes biologiques



La membrane est constituée de trois desprincipaux éléments de base du vivant, des lipides, des protéines etdes glucides. Ces trois éléments coopèrent pour former un film fluidemais néanmoins étanche qui isole la cellule du milieu extérieur et luipermet d'intéragir.



Les lipides membranaires


Ils constituent le coeur de la membrane etsont responsable de son étanchéité à l'eau et par conséquent desmolécules solubles dans l'eau, ce qui constitue la majorité desmolécules biologiques. Les lipides impliqués sont des phospholipideset, chez les eucaryotes, du cholestérol. En solution dans l'eau, lesphospholipides se disposent en un film bimoléculaire de quelquesnanomètres d'épaisseur, le coté apolaire est enfouis au coeur de lamembrane alors que le coté polaire est en contact avec l'eau. Cettestructure est appelée bicouche lipidique, chaque couche de lipideconstituant une demi membrane. La membrane n'est donc pas, comme onpourrait le penser une structure solide mais un liquide emprisonnéeentre deux autres milieux liquides dans lesquels il est insoluble. Elleest donc fluide, les molécules hydrophobes peuvent s'y dissoudre et s'ymouvoir librement, elles ne peuvent toutefois pas passer d'une demimembrane a une autre. Al'inverse, la bicouche bloque totalement lesmolécules polaire.

La fluidité de la membrane est unparametre important pour son fonctionnement correct. Comme pour tousles liquides, elle dépend fortement de la température, augmentant etdiminuant dans le même sens que celle-ci. La cellule doit donc ajusterincessament cette fluidité de façon a compenser les variation detempératures. Elle y arrive modulant la composition en lipide de lamembrane:

1. Les lipides à longue chaine diminuent la fluidité de la membrane.
   
2. L'insaturation des chaines lipidique augmentent la fluidité de la membrane.
   

Pour compenser une augmentation de température la celluleaugmentera la longueur des chaines en diminuant leur insaturation. Pourcompenser une diminution de température la cellule diminuera lalongueur des chaines en augmentant leur insaturation. La resynthèse deslipides membraine est longue et cette adaptation ne joue que si lesvariation de température sont lentes.
Les eucaryotes disposent d'un autre moyende réguler la fluidité : le cholestérol. Ce lipide a en effet lapropriété de réguler la fluidité de la membrane, de la maintenir stabledans une plage étendue de température. Il joue en quelque sorte le rôled'un tampon de fluidité. Sa présence permet une adaptation auxvariations relativement rapides de température. Le cholestérol setrouve principalement dans la demi-membrane extracellulaire. Lesprocaryotes, à quelques rares exceptions près, n'ont pas de cholestérol.




Conformement à leurs habitudesd'étrangeté, les archéobactéries possèdent des lipides que l'on neretrouve nulle part ailleurs dans le monde vivant. Leurs acides grassont reliés au glycérol par des liaisons ether au lieu de liaisonsester et certains d'entre eux, possédant deux extrémités polaires et uncentre apolaire, traversent la membrane dans toute son épaisseur. Ilssont responsables de la résistance de ces cellules aux températures etpH extrèmes auxquels on les trouve.
Les protéines

Une membrane uniquement lipidique n'aaucun usage. D'une part, une telle structure est instable : lesmembranes peuvent fusionner, se séparer, former des embranchements.D'autre part rien ne peux la traverser (à l'exception des gaz), ni lesmolécules polaires qui ne sont pas solubles dans les lipides, ni lesmolécules apolaires qui ne peuvent pas l'atteindre car elles ne peuventpas traverser seules le milieu aqueux qui les entoure. Or si cespropriétés sont exploitées dans la cellule, celle ci a malgré toutbesoin d'une membrane stable ainsi que d'échanger des molécules avec lemilieu extérieur. Ce sont les protéines qui assurent cette fonction.
Les protéines peuvent être disposées dediverses façon par rapport à la membrane : au contact de celle-ci,enchassées dans une demi membrane ou traversant la membrane de part enpart. Part ailleurs, une protéine peut être consituée de plusieurssous-unité qui sont agencées différement avec la membrane. Lesprotéines participent à la polarisation membranaire, une protéine situésur la face externe de la cellule le restera toujours, de même qu'uneprotéine intracellulaire. Pour les protéines qui traversent la membrane(les protéines intramembranaires), les parties extracellulaires etintracellulaires seront toujours les mêmes d'un exemplaire à l'autre dela molécule. Il y a bien sûr des exceptions, certaines fonctionsbiologiques nécessitent des mouvements de protéines au sein de lamembrane, mais il s'agit alors d'une particularité spécifique de laprotéine, pas d'un aspect fondamental de la membrane.
Les protéines sont responsables de laquasi-totalités des spécificités de la membrane. Les molécules polairesne peuvent pas traverser la membrane, ce sont les protéines qui vonts'en charger. A l'inverse, si une molécule polaire ne dispose pas d'uneprotéine capable de lui faire traverser la membrane, elle ne pourra pasla traverser. En choisissant ses protéines, la cellule va pouvoirchoisir quelles molécules vont pouvoir entrer ou sortir. Le rôle desprotéine est toutefois plus large : elles vont transmettre àl'intérieur de la cellules des informations sur le milieur extérieur,elles vont participer à maintenir la forme et la stabilité de lamembrane, elles vont servir de point d'ancrage à des structuresextracellulaire ou intracellulaire et elles sont à l'origine de ladynamique membranaire.


Les glucides

Les protéines assuraient déjà unepolarisation de la membrane, mais ce rôle est principalement dévolu auxglucides. Ils vont en effets former à la surface de la membrane desstructures complexes et variées, mais toujours extracellulaires. Lesglucides sont accrochés à la membrane par deux moyens : ils sont fixésà la surface des protéines intramembranaires (les glycoprotéines) ouaux lipides membraines (les glycolipides).

Ces glucides ont plusieurs rôles :

• Reconnaissance : les motifs glucidiques sont très antigéniques (par exemple les groupes sanguins).
  
• Participation à l'environnement local, les glucides sont des molécules très polaires.
  
• Renforcement de la membrane.
  

Chez les animaux, les glucides forment un feutrage souple appeléglycocalyx. Chez la plupart des autres cellules vivantes, les glucidesforment une paroi résistante et indéformable autour de la cellule :cellulose chez les végétaux, muréine chez les bactéries, qui assure lasolidité de la membrane. Cette paroi ne fait pas à proprement parler dela membrane mais elle s'y accroche par les glucides extracellulaires.


Les membranes sont des structures fluides,interface entre le milieu extracellulaire et intracellulaire que lacellule peut ajuster de façon très spécifique pour répondre à sesbesoins. Elle joue à la fois un rôle de communication avec l'extérieuret un rôle de tri des molécules d'intérêt pour la cellule. Cespropriétés font de la membrane l'un des organites les plus important dela cellule, le seul dont aucune cellule ne peut se passer, mêmetemporairement. C'est aussi le seul que l'on soit arrivé à reproduirepartiellement en laboratoire


Les échanges avec l'extérieur



Une cellule n'est pas un milieu totalement isolé. Elle doit prendre sanourriture dans le milieu extérieur et y rejeter ses dechets. Elle doitaussi le maintient des concentrations ioniques de son milieu interne enpuisant ou rejetant des ions dans son environnement. La cellule yparvient en utilisant des protéines spéciales canaux et pompes et enexploitant diverses énergies, métabolique, potentiel electrochimique,etc...
Les canaux et les transporteurs



La membrane cellulaire, si elle était constituée uniquement de lipide serait totalement étanche. Les molécules hydrophiles ne peuvent pas se dissoudre pour traverser la membrane. Les molécules hydrophobesne peuvent pas traverser la couche polaire qui recouvre la membrane.Pour resoudre ce problème, la cellule contient des protéines enchasséesqui permettent aux molécules de la traversée. Ces protéines ont deuxpropriétés principales, elles sont selectives et elles sont contrôlées.Il existe deux grandes catégories de protéines assurant la traversée dela membrane : des canaux et des pompes.


Les canaux

Les canaux constituent la famille de molécule de transporttransmembranaire la plus représentée dans la cellule. Le principe estsimple, quand le canal est fermé, il est totalement étanche, quand ilest ouvert, sa molécule spécifique le traverse selon son gradientélectrochimique. Si ce gradient s'annule, le mouvement transmembranaires'arrete, s'il s'inverse le mouvement s'inverse également. Les canauxne peuvent en aucun effectuer des transports contre le gradientelectrochimique et sont donc responsable de la diffusion facilité.
Le canal est hautement sélectif, ce qui veux dire qu'il va êtretraversé par une famille de molécule voire une seule molécule. Le canalle moins selectif, comme le canal nicotinique responsable de l'activitémusculaire, laisse passer tous les ions positifs monovalent. A l'autrebout de la chaine, certains canaux, les plus nombreux, laissent passerun seul ion : calcium, sodium, chlore, etc...
Aussi varié sont les modes d'ouverture de ces canaux. Certains sontouverts en permanence. De part le courant ionique qu'ils créent, ilparticipent à la polarisation de la membrane, donc de la composanteélectrique du gradient electrochimique de tous les ions. D'autres'ouvrent sous l'action d'un molécule ou d'un ion. D'autre enfins'ouvrent sous une action mécanique, une variation de potentiel, unevariation de température.
La durée d'ouverture aussi varie. Les canaux peuvent rester ouvert tantque le stimulus est présent, d'autre se referment après quelquesmillisecondes et sont parfois suivit d'une période refractaire ou mêmeune nouvelle stimulation n'ouvrira pas le canal.
Les canaux sont impliqué dans de nombreux phénomène cellulaire. Ils nesont en général pas responsable de la régulation de la compositioncellulaire, mais participent au phénomène d'excitabilité cellulaire.Les dépolarisation et mouvement ioniques qu'ils provoquent assurent desphénomènes tels que la conduction nerveuse, la contraction cellulaire,la sensibilté de certains recepteurs sensoriels, mais aussi lasensibilités aux hormones et aux neurotransmetteurs. Cette variété derôle est permise grace à un nombre élevés de canaux, il n'existe eneffet pas un seul canal calcique dans l'organisme, mais plus d'unedizaine se différenciant par leur mode d'ouverture, leur duréed'ouverture et leur régulation, et c'est le cas de tous les canaux.
Canaux et pathologie

Les canaux transmembranaires sont impliquées dans de nombreusespathologie. La plus connue d'entre elle est la mucoviscidose. Cettemaladie génétique a pour symptome un encombrement des voies aérienneset digestives par un mucus épais et visqueux, il n'est pas suffisamenthydraté. La cause de se défaut d'hydratation est un défaut dans lecanal chlore CTRF (Cystic Fibrosis Transmembrane conductanceRegulator). Ce canal provoque normalement une sortie de chlore descellules épithéliales de la trachée artère, cette sortie de chloreentrainant par pression osmotique une sortie d'eau. Il régule donc laviscosité du mucus.
Ce canal s'ouvre sous l'action de l'ATP . L'ATP se fixe dans une zone nommée Nucleotid Binding Domain (NBD = domaine de fixation des nucléotides). L'ATP est ensuite hydrolyséet le canal se referme. Cette fermeture est suivie d'une périoded'inactivation pendant laquelle le canal ne peut plus être ouvert.
Chez les patients atteind de mucoviscidose, une phénylalanine (un acideaminé) en position 508 de la protéine est manquant. Cette zone est enplein milieu du NBD. Cela suffit à perturber son fonctionnement.L'efflux des ions chlore par un canal pendant son ouverture n'est pasmodifié, ni son temps d'ouverture, mais sa periode refractaire estaugmentée. L'efflux global de chlore est donc fortement diminué. Deplus, le canal fonctionnant mal, la cellule l'elimine de la membrane,ce qui agrave le phénomène.


Les transporteurs ou pompes.

Les transporteurs se différencient des canaux par le fait que ce n'estplus le gradient électrochimique des molécules qui assure le mouvementionique mais le couplage du transport à une réaction enzymatiqueexergonique, comme l'hydrolyse de l'ATP. Le mouvement de la moléculedevient donc unidirectionnel et même se produire contre le gradientelectrochimique.
Le transporteur le plus connu est la pompe Na/K qui expulse trois ionssodium et fait entrer deux ions potassium pour chaque molécule d'ATPhydrolysée. Ce transporteur est très important dans la cellule car ilassure la création et le maintient du gradient électrochimiquemembranaire et est indirectement à l'origine de la plupart desmouvements transmembranaire. Si cette pompe s'arrete, le gradientelectrochimique disparait et les mouvements ioniques s'arrêtent de partet d'autre de la membrane plasmique. D'autres transporteurs trèsimportant dans la cellule sont ceux qui expulsent le calcium ducytoplasme et maintiennent une concentration très basse de l'ordre dela nanomolaire. Cette concentration très basse sera exploitée par lacellule, le calcium est utilisé par de nombreux recepteurs comme signalpour prevenir la cellule de la presence de sa molécule activatrice(hormone en général) sur son site actif.
Une curiosité est le l'ATPaseà proton . Cette molécule présente dans la membrane interne desmitochondries, la membrane des thylacoides et la membrane plasmique desbactéries aérobies. C'est un transporteur qui pour chaque moléculed'ATP hydrolysée peut expulser deux ions hydrogène à travers lamembrane. Toutefois, le gradient electrochimique de l'hydrogène est telque ce canal va fonctionner à l'envers, les ions hydrogène vonttransiter en sens inverse par rapport au sens habituel et l'ATPase vasynthétiser de l'ATP au lieu de l'hydrolyser. C'est cette pompe qui estresponsable de la production d'ATP resultant de la respirationcellulaire.


Les transports couplés.


Ce type de transport est un mélange des deux précédents. Il s'agit d'untransport mais dont l'energie est fournie par un autre ion qui sedéplace selon son gradient électrochimique. Selon le sens dedéplacement respectif des deux molécules on parle de symport (l'ion etla molécule transportée traversent la membrane dans le même sens) oud'antiport (les deux espèces chimiques se déplacent en sens inverse.Ces transports couplés sont très utilisée par la cellule pour recupererles molécules nécessaires à son métabolisme dans le milieu exterieur.Bien que ne consommant pas d'ATP, ce type de transport utilise del'énergie, celle du gradient electrochimique d'un ion. Ce gradient estcrée via l'action d'un transporteur hydrolysant l'ATP ou toute autremolécule énergetique, en général la pompe Na/K.

Transmission intracellulaire de l'information

Notion de récepteur et de second messager



Une cellule en plus de faire transister des molécules à travers samembranes doit savoir ce qui se passe à l'extérieur. La membraneconstitue le seul élément en contact avec l'extérieur. Celle-ci estdotée de molécules spécialisées dans la detection des evènementsexternes et la transmission de l'information à l'intérieur de lacellule en vue d'une réaction spécifique. Certains phénomène detectéssont capables de traverser la membrane comme la lumière ou les hormonesstéroïdes, ils ne feront pas l'objet de ce chapitre.
Les récepteurs

Le terme récepteur en biologie désigne une molécule capable de fixerune autre molécule et d'emettre un signal quand la molécule spécifique(ou ligand) se fixe sur le site de reconnaissance. Les ligands peuventêtre des ions, des métabolites , des hormones, des neurotransmetteursou des facteurs de croissance, des anticorps voire des moléculesbactériennes ou virales. En fait tout ce qu'il est nécessaire à lacellule de détecter dispose d'un récepteur qui lui est propre ou toutau moins à la famille moléculaire à laquelle appartient le ligand. Pourun ligand donné, il peut de plus y avoir plusieurs récepteurs quidifférent par leur sensibilité, leur régulation ou leur expressionspatiale (variation des cellules qui possèdent ce récepteur) outemporelle (variation du récepteur dans le temps). Il existe donc untrès grand nombre de récepteur et leur étude est un des domaine derecherche les plus actif en biologie moléculaire.

Une même molécule peut avoir des effets divers dans un organisme. Achaque action correspond en général un type différent de récepteur.Cela explique l'interêt des récepteurs pour la médecine (en particulierpsychiatrique). La decouverte d'une molécule qui agit sur un seul typede récepteur permet d'obtenir un effet thérapeutique maximal tout enlimitant les effets secondaires. Les molécules qui permettent d'etudierces récepteurs appartiennent au groupe des toxines. Les toxines sontdes molécules qui n'ont aucune homogéneité chimique. Elles sontdéfinies par leurs propriétés : à la fois très spécifiques, agissantsur un seul type ou une seule famille de récepteur et également trèssensibles, la concentration nécessaire pour produire leur effet esttrès basse. Les toxines sont à la base de la classification desrécepteurs. Ainsi, les deux grande familles de récepteurs del'acétylcholine ont été différenciées par leur sensibilités à deuxtoxines : la nicotine (extraite du tabac) et la muscarine (un alcaloideextrait de l'amanite). A l'intérieur de ces deux grands groupes, ilexiste différents sous types de récepteurs qui sont différenciés pard'autres toxines.

Les seconds messagers

Une hormone, un neurotransmetteur ou toute autre molécule reconnue parun récepteur, se fixe sur la seule partie accessible du récepteur, lapartie extracellulaire. Pour que la cellule puisse prendre connaissancede cette fixation, le signal doit être transmis à l'intérieur de lacellule. L'activation du récepteur va declencher une cascade deréaction métabolique qui va avoir pour résultat de libérer une moléculeprécise dans le cytoplasme. Cette molécule va pouvoir transmettrel'information à tous les effecteurs cellulaires. Elle est nommée secondmessager car elle transmet l'information portée par le premier messager: le ligand du récepteur. Il existe plusieurs seconds messagerscorrespondant à différents types de récepteurs cellulaires. L'autrefonction du second messager est de provoquer une amplification dusignal recu : chaque molécule du ligand va activer un seul exemplairedu récepteur qui va produire plusieurs molécules de second messagers.En fonction de l'enzyme activée par le récepteur pour produire lesecond messager, on va distinguer plusieurs catégories de récepteurs.


Les récepteurs à sept domaines transmembranaires







Premiers à être découverts, ils sont en conséquence mieux étudié. Leurnom viens de ce que leur structure spatiale est très homogène à traverstoutes les espèce de la bacterie à l'homme, ils sont constitués d'unechaine protéique unique traversant la membrane plasmique à septreprises. Pendant longtemps on a cru qu'ils étaient le seul type derécepteur cellulaire. Tous ont en commun le fait que l'enzymeproduisant le second messager n'est pas portée par le récepteur luimême. Elle constitue une protéine indépendante, le couplage entre lerécepteur et l'enzyme s'effectuant par une protéine particulière nomméeProtéine G. On distingue deux grandes familles de récepteurs enfonction l'enzyme activée pour synthétiser le second messager : lesrécepteurs activant l'adénylate cyclase et les récepteurs activant laphospholipase C.
Les récepteurs à adénylate cyclase

Ces récepteurs ont été decouverts par Sutherland dans les années 1950et sont à l'origine de la notion de second messager. Sous l'action del'adrénaline, la phosphorylase hépatique peut liberer hydrolyser leglycogène et produire du glucose. L'adrénaline se fixe sur la membraneet la phosphorylase est cytosolique. Par broyat et centrifugation,Sutherland sépare la membrane et le cytosol. L'adrénaline appliquée surle cytosol n'a aucun effet, l'adrénaline n'agit pas directement surl'enzyme. Sur les membranes isolées, il va faire agir l'adrénaline etil recupère le cytosol résultant de cette action. Ce cytosol ajouté aupremier cytosol va declencher l'activation de la phosphorylase. Il enconclut que la fixation de l'adrénaline sur la membrane va provoquer lasynthèse d'une molécule qui va diffuser dans le cytosol et activer laphosphorylase. Il nomme cette molécule un second messager. Des expériences ultérieures montreront que ce second messager est une molécule déja connue à l'époque, l'AMPc ou AMP cyclique.
L'AMPc est une molécule produire par l'adénylate cyclase à partir del'ATP cytosolique. Il s'agit d'une molécule d'AMP, mais l'uniquephosphate est relié à la fois aux carbone 3 et 5 du ribose. L'adénylatecyclase est une protéine membraire localisée dans la demi membraneinterne de la membrane plasmique. Toutefois, elle n'est pas portée parle recepteur membranaire. Ainsi que l'a montré Rodbell dans les années1960, trois molécules sont impliquées dans la synthèse de l'AMPc : lerecepteur à l'adrénaline, l'adénylate cyclase et une système decouplage. Le principe de fonctionnement est celui decrit dans la figureci contre. La fixation du ligand sur le récepteur active la proéineAdenylate Cyclase (AC) qui produit de l'AMPc. Cet AMPc va activer touteune famille de protéines, les protéines kinase A (PKA) qui sontdirectement responsable des effets cellulaires. Une autre protéine, laphosphodiestérase, va degrader l'AMPc en AMP, stoppant ainsi son effet.Dans cette description, le système de couplage est indeterminé. Rodbellmontrera qu'il s'agit d'une qui protéine hydrolyse le GTP et l'appeleradonc protéine G. La protéine G est un hétérotrimère (constituée detrois chaines protéiques différentes) dont les chaines sont nommées α,β et γ. Le site d'hydrolyse du GTP est porté par la chaine α.
Le fonctionnement du système a pu être totalement élucidé. Au repos, lesite enzymatique est occupé par du GDP. La fixation de l'adrénaline surson support va provoquer un changement de conformation des protéinesqui va provoquer l'expulsion du GDP et son remplacement par du GTP.Sous l'action du GTP, la sous unité α de la protéine G va être libéréedu complexe et activer l'adénylate cyclase. L'AMPc synthétisé estlibéré dans le cytosol ou il va activer ses différents effecteurs (dansle cas du foie, la phosphorylase). Au bout d'un temps variable, laprotéine G hydrolyse le GTP en GDP et le complexe avec les chaines betaet gamma se reforme. L'activité de l'adénylate cyclase s'arrète, l'AMPccytosolique est éliminé du cytoplasme par conversion en AMP et l'effetde l'adrénaline cesse totalement.
Les récepteurs couplé à la phospholipase C

Ces recepteurs ont été découverts dans les années 50 par Hokin qui aconstaté que l'acétylcholine stimulait le métabolisme desphosphatidyl-inositol. Sous l'action de son hormone, la phospholipase Cva hydroliser les lipides membranaires et libérer du diacyl-glycérol(DAG) et de l'inositol triphosphate (IP3). Ces deux molécules vontfaire office de seconds messagers :

• leDAG va activer la protéine kinase C (PKC). Cette protéine migre de lamembrane dans le cytoplasme (famille A, sensible au calcium) et parfoisvers le noyau (famille B, insensible au calcium). Cette famille deprotéine va phosphoryler diverses protéines cellulaires et ainsi lesactiver.
  
• L'inositol phopshate va provoquer une entrée de calcium dans lecytoplasme en agissant sur deux reserve, le calcium extracellulaire oule calcium stocké à l'intérieur de la cellule dans le reticulumendoplasmique lisse en ouvrant des canaux membranaires. Le calcium estdans cette voie, le véritable second messager. Il va activer diversesprotéines, modulée par la concentration en calcium plasmatique (d'ouleur nom de calmoduline).
  

La voie du DAG et la voie de l'IP3 agissent de façon synergiques sur leurs cibles.
Comme les récepteurs à adénylate cyclase, ceux couplés à laphospholipase C sont activés par le DAG. Mais il existe deux autresvoies :

• La phosphorylation par une tyrosine kinase.
  
• Activation par le calcium.
  

Les recepteurs enzymes





Les récepteurs enzymes sont des récepteurs membranaires doncl'occupation du site actif se traduit par une activité enzymatiqueintracellulaire par le récepteur même. Ils sont très importants chezles animaux car ils interviennent dans de nombreux processus derégulation de la division cellulaire et dans l'immunité, ainsi que dansd'autres domaines. On distingue deux catégories de récepteursenzymatiques : les récepteur tyrosine kinases et les guanylatecyclases. Les tyrosine kinases

Les tyrosine kinases constituent une famille d'enzymes très importante dans l'organisme eucaryote. Ces molécules ont en commun la propriété de phosphoryler un résidutyrosine. Cette méthode est une méthode d'activation ou d'inactivationde certaines voies enzymatiques au sein de la cellule. La plupart deces kinases sont des récepteurs membranaires.
Structure et fonctionnement des récepteurs


Les récepteurs tyrosine kinases sont des molécules transmembranairescomportant un site récepteur sur la face extracellulaire et un sitetyrosine kinase sur la face interne. Les deux parties sont reliées parun seul segment transmembranaire. Les récepteurs tyrosine kinasecomportent aussi un site de phosphorylation. Leur site kinase estnormalement inactif, pour être activé, leur résidu tyrosine doitd'abord être phosphorylé. Le schéma ci contre présente un récepteurtyrosine kinase type. Dans la réalité, ces récepteurs peuvent êtrebeaucoup plus complexes, pouvant acceuillir differentes site dephosphorylation, plusieurs sites enzymatiques et la structureextramembranaire pouvant être très variée, comportant plusieurs sitesde reconnaissante, voire un site de reconnaissance constitué deplusieurs protéines
Le mécanisme d'activation de ces récepteurs est particulier, car lesegments transmembranaire, ne peut pas transmettre d'information surl'occupation du site de reconnaissance du ligandvers l'intérieur de la cellule. Le ligand va se fixer deux récepteursqui vont être ainsi rapprochés et pouvoir se phosphoryler mutuellement.L'activité tyrosine kinase va alors pouvoir s'exercer sur leursdifférentes molécules cibles.
Une fois phosphorylé, le récepteur ne peut plus être dephosphorylé. Sonactivité enzymatique va donc se poursuivre indéfiniment. Pour stopperson action, la cellule va internaliser le récepteur. La protéine vaensuite être degradée dans un lysosyme ou dans certains cas renvoyée àla surface de la membrane après inactivation pour être reutilisée.
Phénomènes cellulaires impliquant un récepteur tyrosine kinase

On rencontre ce type de récepteur dans les phénomènes de communicationintercellulaires. Une catégorie d'hormones appelée facteurs decroissance utilise ce genre de récepteurs. Ils sont donc à un carrefourmajeur dans le contrôle de la multiplication cellulaire chez lesvertébrés. Cela explique de nombreux oncogènesse revèlent coder pour ces récepteurs et leur dysfonctionnement est àl'origine de nombreux cancers. Ils sont responsable aussi de l'effetcancérigène de certains virus. Ainsi l'un d'eux produit une protéinequi s'insère dans la membrane plasmique et possède une activitétyrosine kinase constitutive, générant sans cesse un signal demultiplication cellulaire.
Un deuxième grand domaine d'action de ces cellules est l'immunité. Lesanticorps ayant reconnus leur antigène activent un récepteur de cegenre sur leurs cellules cibles. De même, les molécules du complexemajeur d'hystocompatibilité (appelé HLA chez l'homme), responsable dela différenciation entre le soi et le non soi fonctionne en utilisantdes récepteurs tyrosine kinase.
Dans la régulation métabolique, ces récepteurs sont peu représenté. Uneexception majeure cependant, le récepteur de l'insuline, l'hormonehypoglycemiante, est de type tyrosine kinase.
Les guanylate cyclase

Ces récepteurs possèdent une enzyme qui produit du GMPc à partir deGTP, l'équivalent de l'AMPc mais en utilisant la guanine au lieud'adénine comme base azotée. Les voies de production sont en revanchetotalement diffrentes puisque l'AMPc est produite via un récepteur à 9segments transmembranaires.
Il existe deux types de guanylate cyclase, une membranaire et unesoluble. La seconde a été la plus étudiée car elle intervient dans unmécanisme qui a surpris plus d'un biologiste lors de sa découverte. Eneffet, son ligand n'est autre que le monoxyde d'azote ou NO, un gazsoluble et à durée de vie très courte. Ce NO est produit par l'endotheliumvasculaire et diffuse jusqu'aux cellules de la couche musculaire. Laguanylate cyclase ainsi activée va produire du GMPc qui par diversvoies va aboutir à la relaxation des fibres musculaires lisses duvaisseau sanguin, ce qui explique l'effet vasodilatateur du NO.


يتبع ...

شكــــــــــــــــــرا

merciiiiiiiii

العفو حبيباتي شكرا لتواجدكم منورين